因NK細(xì)胞是一種比較難培養(yǎng)的細(xì)胞。培養(yǎng)過程會(huì)涉及很多問題，如：細(xì)胞接種密度如何？NK細(xì)胞有哪些特性？NK細(xì)胞具有哪些形態(tài)特征？......

       使用的NK細(xì)胞培養(yǎng)套裝為無飼養(yǎng)層細(xì)胞體外擴(kuò)增技術(shù)，以外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）為起始種子細(xì)胞，結(jié)合多種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)和刺激，實(shí)現(xiàn)NK細(xì)胞體外特異性的高效擴(kuò)增。具有適用性強(qiáng)，對(duì)種子細(xì)胞的來源選擇性好，不需包被；無飼養(yǎng)層培養(yǎng)工藝，簡化操作，提高產(chǎn)品安全性；使用多種細(xì)胞因子及小分子物質(zhì)聯(lián)合刺激，充分活化效應(yīng)細(xì)胞等技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

       試劑：NK細(xì)胞培養(yǎng)套裝；

       耗材：培養(yǎng)瓶；細(xì)胞培養(yǎng)袋；移液管；采血袋等。

       操作過程：

       D0：白細(xì)胞層分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)

       臍血經(jīng)病毒檢測(cè)合格后，送入實(shí)驗(yàn)室中。取70ml臍血，按常規(guī)的血漿及PBMC分離方法分離獲得血漿和白細(xì)胞層。白細(xì)胞層經(jīng)洗滌，計(jì)數(shù)為7.4*107，以1.5*106個(gè)/ml密度接種在培養(yǎng)瓶中。加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基、因子及滅活血漿，放置在37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

       注意事項(xiàng)：

       1、臍血盡可能采集新鮮血液，否則容易凝血；

       2、需注意Ficoll的溫度，否則易混雜較多紅細(xì)胞；

       3、注意離心的升降速設(shè)置，否則無法獲得白細(xì)胞層。

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       D2：顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況：

       細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)刺激，有明顯的半貼壁聚團(tuán)生長，部分細(xì)胞聚團(tuán)懸浮生長。細(xì)胞略有增殖，增殖不明顯。

       20*物鏡

       D3：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充誘導(dǎo)培養(yǎng)基

       細(xì)胞經(jīng)過二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，半懸浮貼壁較D2增多，細(xì)胞聚團(tuán)更為明顯。

       注意事項(xiàng)：前3天不能劇烈晃動(dòng)細(xì)胞，避免干擾細(xì)胞成團(tuán)。

       10*物鏡

       D5：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基

       經(jīng)過兩天的培養(yǎng)，半懸浮貼壁的細(xì)胞已開始懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基顏色變黃。細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.1*106/ml，補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基，刺激NK細(xì)胞增殖。

       10*物鏡

       D7：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基

      培養(yǎng)基顏色變黃，顯微鏡下可明顯看到細(xì)胞聚團(tuán)增大。細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.0*106/ml，補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度，刺激NK細(xì)胞增殖。細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋中培養(yǎng)。略微吹打細(xì)胞，使細(xì)胞團(tuán)略微分散。輕晃培養(yǎng)袋，使細(xì)胞分散培養(yǎng)。

       10*物鏡

       D9：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基

       培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃，取細(xì)胞計(jì)數(shù)并將細(xì)胞放置在細(xì)菌皿中觀察形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已基本分散生長。細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.5*106/ml，補(bǔ)充培養(yǎng)基。

       10*物鏡

       D11：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基

       培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃，取細(xì)胞計(jì)數(shù)并將細(xì)胞放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中觀察形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已呈不規(guī)則形態(tài)，部分細(xì)胞有觸角伸出。細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.7*106/ml，補(bǔ)充培養(yǎng)基。

       10*物鏡                                                            

       40*物鏡

       D12：細(xì)胞觀察并補(bǔ)充增殖培養(yǎng)基（本次非常規(guī)補(bǔ)液）

       培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃，取細(xì)胞計(jì)數(shù)并將細(xì)胞放置在細(xì)菌皿中觀察形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)與D11基本類似，取細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.5*106/ml，補(bǔ)充培養(yǎng)基。

       流式細(xì)胞檢測(cè)：CD3-/CD16+CD56+為82.74%

       10*物鏡                                                            

       40*物鏡

       D12-NK細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果

       D14：細(xì)胞檢測(cè)

       培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基變黃，取細(xì)胞計(jì)數(shù)并將細(xì)胞放置在細(xì)菌皿中觀察形態(tài)，取細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。細(xì)胞計(jì)數(shù)為2.0*106/ml。

       流式細(xì)胞檢測(cè)：CD3-/CD16+CD56+為90.98%

       10*物鏡                                                          

       40*物鏡

       D14-NK細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果

       (一)X-VIVO無血清造血細(xì)胞培養(yǎng)基

       這個(gè)系列是屬于化學(xué)成分限定培養(yǎng)基，為包括淋巴因子激活殺傷細(xì)胞(LAK)、外周血淋巴細(xì)胞(PBL)和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)在內(nèi)的多種細(xì)胞提供營養(yǎng)完整和平衡的環(huán)境。此類培養(yǎng)基不包含任何外源性生長因子、人工促進(jìn)細(xì)胞增殖的物質(zhì)或未定義的補(bǔ)充物。它們不含任何蛋白激酶C刺激因子，適用于研究人類和小鼠淋巴細(xì)胞激活中的第二信使系統(tǒng)。

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